Bereits im Jahr 1520 wehte der Geist des Wandels durch St. Margrethen: Der aus Rorschach stammende Pfarrer Gregor Heer trat unter dem direkten Einfluss der Reformatoren Huldrych Zwingli und Joachim Vadian früh für den neuen Glauben ein. Anfang 1529 wurde die Reformation im Grenzdorf offiziell eingeführt. Doch der Weg war steinig. Nach den Wirren der Kappeler Kriege mussten Pfründgüter und Pfarrhaus an die Katholiken zurückgegeben werden, und dem evangelischen Pfarrer wurde nur noch eine Behelfswohnung zugewiesen.
Die Folgezeit war von schweren Konflikten geprägt. Das Recht zur Besetzung der Pfarrstelle (Kollaturrecht) lag bei der Abtei St. Gallen, was zu ständigen Misshelligkeiten über die freie Ausübung des evangelischen Gottesdienstes führte. Die Spannungen im Ort waren so gewaltig, dass zwischen 1610 und 1635 die Pfarrstelle sage und schreibe siebzehnmal neu besetzt werden musste.
„Siebzehn Pfarrerwechsel in 25 Jahren – ein bewegtes Zeugnis für den unwegsamen Kampf um Glaubensfreiheit im Rheintal.“
Trotz dieser Zerrissenheit rafften sich beide Konfessionen im Jahr 1664 zusammen, um das gemeinsame, baufällig gewordene „alte Kirchlein“ wiederherzustellen. Dank grosszügiger Hilfe auswärtiger Bürger und befreundeter evangelischer Kantone konnte schliesslich 1682 auch ein eigenes reformiertes Pfarrhaus gebaut werden.
Der endgültige Befreiungsschlag folgte im Jahr 1806: Mit tatkräftiger Unterstützung von auswärts und den freiwilligen Beiträgen der lokalen Gemeindeglieder errichteten die Evangelischen ihre eigene, eigenständige Kirche. Damit endete die jahrhundertelange Doppelnutzung des mittelalterlichen Gotteshauses, das ab diesem Moment vollständig an die katholische Gemeinde übergeben werden konnte.